NECTIN1의 손실은 국소 IGF1 고갈 시 흑색종 확산을 유발합니다

Nature Genetics 54권, 1839~1852페이지(2022)이 기사 인용

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암 유전학은 많은 종양 억제 경로와 발암 경로를 밝혀냈지만 종양 확산과 관련된 메커니즘은 거의 밝혀지지 않았습니다. 여기에서 우리는 55%의 경우 부착 접합 유전자 NECTIN1을 비활성화하는 인간 흑색종에서 세 번째로 중요한 염색체 결실의 역할을 조사했습니다. 우리는 NECTIN1 손실이 체외에서 흑색종 세포 이동을 자극하고 특히 IGF1 신호 전달 감소에 반응하여 제브라피시와 인간 종양 모두에서 생체 내 확산을 촉진한다는 것을 발견했습니다. 인간 흑색종 생검 표본에서 유착 접합부는 IGF1 수준이 낮은 부위에서만 관찰되었지만 NECTIN1 결핍 종양에서는 관찰되지 않았습니다. 우리의 연구에서는 NECTIN1이 흑색종 전파의 주요 결정 요인임을 확인하고 미세 환경 신호에 대한 반응의 유전적 제어를 밝혀냈습니다.

고형 종양의 임상적 과제는 전이의 형성입니다1. 흑색종에서는 종양 전파가 사망의 주요 원인입니다2. 종양 전파에 유전적 병변이 관련되어 있다는 연구는 거의 없지만, 췌장암에 대한 초기 연구에서는 모 원발 종양 내에서 전이성 클론이 발견되었으며 전이의 유전적 특징이 없음을 시사했습니다4. 최근에는 전이와 일치하는 원발 종양의 게놈 비교를 통해 종양 확산의 유전적 동인을 식별하지 못했으며5,6,7, 이는 전이에서 비암 세포 자율 메커니즘의 역할을 지적합니다8. 전이성 특성에 대한 종양 미세환경의 유전적 변화와 신호의 상대적인 기여는 여전히 논란의 여지가 있습니다9.

세포-세포 접착의 변화와 같은 원발 종양으로부터의 세포 분리 또는 국소 종양 침입과 관련된 초기 사건은 상피 종양에서 광범위하게 연구되었습니다. 예를 들어 E-cadherin 손실은 췌장암11에서 전이를 촉진하는 것으로 보고되었으며11 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 전이의 초기 동인 역할을 합니다12,13. 그러나 흑색종과 같은 비상피암에서는 세포-세포 접착의 역할이 아직 파악하기 어렵습니다. 멜라닌 세포 자체는 배아 발생 중에 신경 능선에서 나타나므로 상피 기능보다 중간엽 기능이 더 많습니다. E-cadherin 발현의 상실은 공동 배양 실험에서 멜라닌 세포와 인접한 각질 세포 사이의 상호 작용을 방해함으로써 흑색종 진행을 선호하는 것으로 나타났으며 카드 헤린 패턴의 차이, 특히 E-cadherin에서 N-cadherin으로의 전환이 비교된 흑색종 전이에서 주목되었습니다 원발성 종양16. 그러나 비상피 종양의 전이성 파종에 대한 세포-세포 접착 변화의 기여를 설명하는 기능적 증거는 부족합니다.

여기에서 우리는 흑색종 전파의 빈번한 동인으로 NECTIN1 유전자의 결실을 확인했습니다. NECTIN1은 두 세포 사이의 동형 또는 이형 상호작용에 관여하여 초기 부착 접합을 확립할 수 있는 접착 분자입니다. 우리는 NECTIN1 손실이 세포-세포 접착에서 세포-기질 접착으로의 전환을 제어함으로써 미세 환경 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1) 신호에 대한 흑색종 세포의 반응을 변경한다는 것을 발견했습니다. 이 메커니즘은 부착 접합 상태와 국소 성장 인자 농도를 통합하여 암세포가 틈새에 머물거나 떠나도록 결정합니다.

363개의 인간 흑색종에 대한 The Cancer Genome Atlas(TCGA) 코호트에서 카피 수 변경20,21을 분석함으로써 우리는 chr11q23.3에서 세 번째로 가장 중요한 초점 결실에는 NECTIN1 유전자만 포함되어 있음을 발견했습니다(그림 1a 및 확장 데이터 그림 1a). ,비). NECTIN1의 이중 대립유전자 소실은 4.4%의 사례(16건)에서 발견되었지만 흑색종의 절반은 얕은 결실(186건)을 나타내어 전체 삭제 빈도는 55%였습니다(그림 1b). 대부분의 삭제는 전체 유전자좌에 영향을 미쳤으며 얕은 삭제는 하나의 NECTIN1 대립 유전자를 제거하여 이형 접합 손실을 초래할 가능성이 있습니다 (확장 데이터 그림 1c, d). NECTIN1 손실은 주요 종양 유전자(BRAF 및 NRAS) 또는 종양 억제 유전자(NF1, CDKN2A, TP53 및 PTEN)의 변경과 상관관계가 없었습니다(확장 데이터 그림 1e). NECTIN1 mRNA 발현은 선형 카피 수(확장 데이터 그림 2a)와 상관관계가 있으며, NECTIN1의 깊거나 얕은 결실이 있는 인간 흑색종 샘플은 이배체 샘플보다 훨씬 적은 NECTIN1 mRNA를 발현합니다(확장 데이터 그림 2b). 인간 흑색종에서 NECTIN1에 대한 면역조직화학은 NECTIN1 단백질 수준이 원발 종양에 비해 전이에서 유의하게 더 낮다는 것을 보여주었습니다(그림 1c, d 및 확장 데이터 그림 2c). NECTIN1 염색이 낮은 샘플에서는 전이가 과도하게 나타나는 반면, NECTIN1이 높은 샘플은 원발성 흑색종에 대해 풍부해졌습니다(확장 데이터 그림 2d). 인간 흑색종에서 NECTIN1 상태는 E-cadherin의 발현과 상관관계가 없었습니다. E-cadherin은 여러 암에서 전이성 진행과 관련이 있는 손실이 있는 또 다른 부착 접합 구성 요소입니다(확장 데이터 그림 2e). 20개 인간 흑색종 조직 절편의 공동면역형광법도 NECTIN1과 E-cadherin 단백질 수준 사이의 상관관계를 밝히지 못했습니다(확장 데이터 그림 2f,g). 중요한 것은 NECTIN1 결실이 피부 흑색종 환자의 전체 생존율 감소와 관련이 있다는 것입니다(그림 1e). 함께, 이 데이터는 NECTIN1을 전이에서 잠재적인 역할을 하는 흑색종에서 자주 변경되는 유전자로 지정합니다.

−0.25: no deletion, n = 190; < −0.25: deletion, n = 168 (log-rank test)./p> 0.05). Some of the most differentially expressed proteins are indicated. b–e, Adhesion of A375 human melanoma cells stably expressing an shRNA directed against NECTIN1 (shNECTIN1) relative to cells expressing a control shRNA (shCTRL) to collagen-I-, fibronectin-, laminin- or vitronectin-coated surfaces at various timepoints after seeding. Data represent mean ± s.d. of four independent experiments (paired two-tailed t-test). f, Western blot analysis of ITGB levels in the cells described in panel b transfected with a control siRNA (C) or siRNAs targeting ITGB1 (1), ITGB2 (2), ITGB3 (3), ITGB4 (4) or ITGB5 (5). Data are representative of four independent experiments. g, Migration of the cells described in panel f relative to cells stably expressing a control shRNA (shCTRL) and transfected with a control siRNA in a transwell assay after 12 h of serum starvation. Cells were allowed to migrate for 6 h. Data represent mean ± s.d. of four independent experiments (paired two-tailed t-test; P values are shown for the comparisons siITGB versus siCTRL (shNECTIN1)). h, Migration of A375 human melanoma cells stably expressing an shRNA directed against NECTIN1 (shNECTIN1) relative to cells expressing a control shRNA (shCTRL) in a transwell assay upon treatment with an integrin α6β4 blocking antibody (ITG Ab, GoH3, 40 μg ml−1). Cells were allowed to migrate for 6 h. Data represent mean ± s.d. of four independent experiments (paired two-tailed t-test). IgG, immunoglobulin G. i, Migration of A375 human melanoma cells stably expressing an shRNA directed against NECTIN1 (shNECTIN1) relative to cells expressing a control shRNA (shCTRL) in a transwell assay upon treatment with two integrin αvβ3 and αvβ5 inhibitors (ITGi#1: SB273005; ITGi#2: echistatin). Cells were allowed to migrate for 6 h. Data represent mean ± s.d. of four independent experiments (paired two-tailed t-test)./p>10% of targeted cells and 3 = strong and complete homogenous staining in >10% of targeted cells). Data analysis was done using GraphPad Prism./p>

10% of cells, or 3 = strong and complete homogenous staining in > 10% of cells. Scale bar: 50 μm. Representative of 3 independent tissue-microarrays. (d) Distribution of NECTIN1 staining level by immunohistochemistry in 253 tissue sections of human primary melanomas or metastases. Correlation was measured by Chi-square test. (e) Dot plot representing NECTIN1 and CDH1 mRNA expression in the TCGA cohort of human cutaneous melanomas (363 samples). Spearman correlation: r = −0.08, p = 0.107. Four outliers with high NECTIN1 expression were removed from the graph but retained in the analysis. (f) Immunofluorescence analysis of E-cadherin (green) and NECTIN1 (red) on tissue sections of 4 different human melanomas exhibiting different staining patterns: from left to right and top to bottom: double positive, single E-cadherin-positive, single NECTIN1-positive, double negative. Scale bar: 10 μm. BV, blood vessel. Representative examples of the cases described in g. (g) Distribution of NECTIN1 and E-cadherin positivity by immunofluorescence in 20 sections of human melanoma. Correlation was measured by Chi-square test./p>